Javascript зараз адключаны ў вашым браўзеры.Калі javascript адключаны, некаторыя функцыі гэтага сайта не будуць працаваць.
Хаўер Фідальга, * П'ер-Антуан Дэглесн, * Радрыга Ароё, * Ліліян Сепульведа, * Яўгенія Раннева, Дэпартамент навукі Філіпа Дэпрэ, Skin Tech Pharma Group, Кастэла Д'Эмпурыес, Каталонія, Іспанія * Гэтыя аўтары маюць некаторыя меркаванні аб гэтай працы Equal Даведачная інфармацыя: Гіалуроновая кіслата (ГК) - гэта натуральны поліцукрыд, які выкарыстоўваецца ў вытворчасці скурных напаўняльнікаў у эстэтычных мэтах.Паколькі перыяд паўраспаду ў тканінах чалавека складае некалькі дзён, скурныя напаўняльнікі на аснове ГК хімічна мадыфікуюцца, каб падоўжыць іх жыццё ў арганізме.Найбольш распаўсюджанай мадыфікацыяй камерцыйных напаўняльнікаў на аснове ГК з'яўляецца выкарыстанне 1,4-бутандиолдиглицидилового эфіру (BDDE) у якасці сшывальнага агента для сшывання ланцугоў ГК.Рэшткавы BDDE або BDDE, які не прарэагаваў, лічыцца нетоксичным пры колькасці <2 частак на мільён (ppm);такім чынам, рэшткавы BDDE ў канчатковым скурным напаўняльніку павінен быць колькасна вызначаны для забеспячэння бяспекі пацыента.Матэрыялы і метады: гэта даследаванне апісвае выяўленне і характарыстыку пабочнага прадукту рэакцыі сшывання паміж BDDE і HA ў шчолачных умовах шляхам спалучэння вадкаснай храматаграфіі і мас-спектраметрыі (LC-MS).Вынікі: пасля розных аналізаў было выяўлена, што шчолачныя ўмовы і высокая тэмпература, якія выкарыстоўваюцца для дэзінфекцыі гідрагеля HA-BDDE, спрыялі ўтварэнню гэтага новага пабочнага прадукту, «прапіленгліколь-падобнага» злучэння.Аналіз LC-MS пацвердзіў, што пабочны прадукт мае тую ж монаізатопную масу, што і BDDE, іншы час утрымання (tR) і іншы рэжым паглынання УФ (λ=200 нм).У адрозненне ад BDDE, у аналізе LC-MS было заўважана, што пры аднолькавых умовах вымярэння гэты пабочны прадукт мае больш высокую хуткасць выяўлення пры 200 нм.Выснова: гэтыя вынікі паказваюць, што ў структуры гэтага новага злучэння няма эпаксіду.Абмеркаванне адкрыта для ацэнкі рызыкі гэтага новага пабочнага прадукту, выяўленага пры вытворчасці гідрагелю HA-BDDE (скурнага напаўняльніка HA) у камерцыйных мэтах.Ключавыя словы: гіалуроновая кіслата, скурны напаўняльнік HA, сшытая гіалуроновая кіслата, BDDE, аналіз LC-MS, пабочны прадукт BDDE.
Філлеры на аснове гіалуроновой кіслаты (ГК) - найбольш распаўсюджаныя і папулярныя скурныя напаўняльнікі, якія выкарыстоўваюцца ў касметычных мэтах.1 Гэты скурны напаўняльнік уяўляе сабой гідрагель, які звычайна складаецца з >95% вады і 0,5-3% ГК, што надае ім гелеобразную структуру.2 ГК - поліцукрыд і асноўны кампанент пазаклеткавага матрікса пазваночных жывёл.Адзін з інгрэдыентаў.Ён складаецца з (1,4)-глюкуроновой кіслаты-β (1,3)-N-ацэтылглюкозамін (GlcNAc), паўтаральных адзінак дисахарида, злучаных глікозіднымі сувязямі.Гэтая мадэль дысахарыдаў аднолькавая ва ўсіх арганізмах.У параўнанні з некаторымі бялковымі напаўняльнікамі (напрыклад, калагенам), гэта ўласцівасць робіць ГК вельмі біясумяшчальнай малекулай.Гэтыя напаўняльнікі могуць дэманстраваць спецыфічнасць паслядоўнасці амінакіслот, якую можа распазнаць імунная сістэма пацыента.
Пры выкарыстанні ў якасці скурнага напаўняльніка асноўным абмежаваннем ГК з'яўляецца яе хуткі абарот у тканінах з-за наяўнасці спецыфічнага сямейства ферментаў, званых гіалуранідазамі.Да гэтага часу было апісана некалькі хімічных мадыфікацый у структуры ГК для павелічэння перыяду паўраспаду ГК у тканінах.3 Большасць з гэтых мадыфікацый спрабуюць паменшыць доступ гиалуронидазы да палімераў поліцукрыдаў шляхам сшывання ланцугоў НА.Такім чынам, з-за ўтварэння масткоў і міжмалекулярных кавалентных сувязей паміж структурай ГК і сшываючым агентам гідрагель ГК з папярочнай сувяззю вырабляе больш прадуктаў антыферментнага раскладання, чым натуральная ГК.4-6
Да гэтага часу хімічныя сшывальнікі, якія выкарыстоўваюцца для вытворчасці пашытай ГК, уключаюць метакрыламід, 7 гідразід, 8 карбодиимид, 9 дивинилсульфон, 1,4-бутандиол диглицидиловый эфир (BDDE) і поли(этыленгліколь) диглицидиловый эфир.10,11 BDDE з'яўляецца найбольш часта выкарыстоўваным сшываючым агентам.Нягледзячы на тое, што гэтыя тыпы гідрагеляў былі даказаны як бяспечныя на працягу дзесяцігоддзяў, сшываючыя агенты, якія выкарыстоўваюцца, з'яўляюцца рэактыўнымі рэагентамі, якія могуць быць цітатоксічнымі і, у некаторых выпадках, мутагеннымі.12 Такім чынам, іх рэшткавае ўтрыманне ў канчатковым гідрагель павінна быць высокім.BDDE лічыцца бяспечным, калі рэшткавая канцэнтрацыя складае менш за 2 часткі на мільён (праміле).4
Ёсць некалькі метадаў вызначэння нізкай астаткавай канцэнтрацыі BDDE, ступені сшывання і пазіцыі замяшчэння ў гідрагелях НА, такіх як газавая храматаграфія, эксклюзіўная храматаграфія ў спалучэнні з мас-спектраметрыяй (МС), метады вымярэння флуарэсцэнцыі ядзернага магнітнага рэзанансу (ЯМР) і Высокаэфектыўная вадкасная храматаграфія (ВЭЖХ) з дыёднай матрыцай.13-17 У гэтым даследаванні апісваецца выяўленне і характарыстыка пабочнага прадукту ў канчатковым гідрагелі пашытай ГК, атрыманай у выніку рэакцыі BDDE і ГК у шчолачных умовах.ВЭЖХ і вадкасная храматаграфія-мас-спектраметрыя (LC-MS аналіз).Паколькі таксічнасць гэтага пабочнага прадукту BDDE невядомая, мы рэкамендуем вызначаць колькаснае вызначэнне яго астатку аналагічным спосабам, які звычайна праводзіцца для BDDE ў канчатковым прадукце.
Атрыманая натрыевая соль HA (Shiseido Co., Ltd., Токіо, Японія) мае малекулярную масу ~1 368 000 Да (метад Ларана) 18 і ўласцівую глейкасць 2,20 м3/кг.Для рэакцыі сшывання BDDE (≥95%) быў набыты ў Sigma-Aldrich Co. (Сэнт-Луіс, Місуры, ЗША).Фасфатны буферны раствор з pH 7,4 быў набыты ў кампаніі Sigma-Aldrich.Усе растваральнікі, ацэтанітрыл і вада, якія выкарыстоўваліся ў аналізе LC-MS, былі набыты ў ВЭЖХ класа якасці.Мурашыная кіслата (98%) закупляецца х.ч.
Усе эксперыменты праводзіліся на сістэме UPLC Acquity (Уотэрс, Мілфард, Масачусэтс, ЗША) і падлучаны да патройнага квадрупольнага мас-спектрометра API 3000, абсталяванага крыніцай іянізацыі з электрараспыленнем (AB SCIEX, Фрэмінгем, Масачусэтс, ЗША).
Сінтэз сшытых гідрагеляў НА быў пачаты даданнем 198 мг BDDE да 10% (мас./мас.) раствора гіалуроната натрыю (NaHA) у прысутнасці 1% шчолачы (гідраксід натрыю, NaOH).Канчатковая канцэнтрацыя BDDE ў рэакцыйнай сумесі была 9,9 мг/мл (0,049 ммоль).Затым рэакцыйную сумесь старанна змешваюць і гамагенізуюць і пакідаюць настойвацца пры 45°C на працягу 4 гадзін.19 pH рэакцыі падтрымліваецца на ўзроўні ~12.
Пасля гэтага рэакцыйную сумесь прамывалі вадой, а канчатковы гідрагель HA-BDDE фільтравалі і разводзілі буферам PBS для дасягнення канцэнтрацыі HA ад 10 да 25 мг/мл і канчатковага рн 7,4.Для таго, каб стэрылізаваць вырабленыя гідрагелі пашытай ГК, усе гэтыя гідрагелі автоклавируются (120°C на працягу 20 хвілін).Вычышчаны гідрагель BDDE-HA захоўваецца пры 4°C да аналізу.
Каб прааналізаваць BDDE, які прысутнічае ў пашытым прадукце HA, узважылі 240 мг пробы і ўвялі ў цэнтральнае адтуліну (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, ЗША; аб'ём 0,5 мл) і цэнтрыфугавалі пры 10 000 абаротаў у хвіліну пры пакаёвай тэмпературы. 10 хвілін.Было сабрана і прааналізавана ў агульнай складанасці 20 мкл вадкасці, якая выцягваецца.
Для аналізу стандарту BDDE (Sigma-Aldrich Co) у шчолачных умовах (1%, 0,1% і 0,01% NaOH), пры выкананні наступных умоў, проба вадкасці складае 1:10, 1:100 або да 1:1 000 000 Пры неабходнасці выкарыстоўвайце для аналізу дэіянізаваную ваду MilliQ.
Для зыходных матэрыялаў, якія выкарыстоўваюцца ў рэакцыі сшывання (HA 2%, H2O, 1% NaOH і 0,049 ммоль BDDE), 1 мл кожнага ўзору, прыгатаванага з гэтых матэрыялаў, аналізавалі з выкарыстаннем тых жа ўмоў аналізу.
Для вызначэння спецыфічнасці пікаў, якія з'яўляюцца на карце іёнаў, 10 мкл стандартнага раствора BDDE 100 частак на мільярд (Sigma-Aldrich Co) было дададзена да ўзору аб'ёмам 20 мкл.У гэтым выпадку канчатковая канцэнтрацыя стандарту ў кожным узоры складае 37 ppb.
Спачатку прыгатуйце зыходны раствор BDDE з канцэнтрацыяй 11 000 мг/л (11 000 праміле), развядучы 10 мкл стандартнага BDDE (Sigma-Aldrich Co) 990 мкл вады MilliQ (шчыльнасць 1,1 г/мл).Выкарыстоўвайце гэты раствор для падрыхтоўкі раствора 110 мкг/л (110 частак на мільярд) BDDE у якасці прамежкавага стандартнага развядзення.Затым выкарыстоўвайце прамежкавы стандартны разбаўляльнік BDDE (110 частак на мільярд), каб падрыхтаваць стандартную крывую, разводзячы прамежкавы разбаўляльнік у некалькі разоў, каб дасягнуць патрэбнай канцэнтрацыі 75, 50, 25, 10 і 1 частак на мільярд.Як паказана на малюнку 1, выяўлена, што стандартная крывая BDDE ад 1,1 да 110 частак на мільярд мае добрую лінейнасць (R2>0,99).Стандартная крывая паўтаралася ў чатырох незалежных эксперыментах.
Малюнак 1 Стандартная калібравальная крывая BDDE, атрыманая з дапамогай аналізу LC-MS, у якой назіраецца добрая карэляцыя (R2>0,99).
Скарачэнні: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидиловый эфір;ВХ-МС, вадкасная храматаграфія і мас-спектраметрыя.
Для ідэнтыфікацыі і колькаснай ацэнкі стандартаў BDDE, якія прысутнічаюць у пашытай HA, і стандартаў BDDE у базавым растворы быў выкарыстаны аналіз LC-MS.
Храматаграфічнае раздзяленне было дасягнута на калонцы LUNA 2,5 мкм C18(2)-HST (50×2,0 мм2; Phenomenex, Torrance, CA, ЗША) і захоўвалася пры пакаёвай тэмпературы (25°C) падчас аналізу.Рухомая фаза складаецца з ацэтанітрылу (растваральнік А) і вады (растваральнік Б), які змяшчае 0,1% мурашынай кіслаты.Рухомая фаза элюируется градыентным элюированием.Градыент наступны: 0 хвілін, 2% A;1 хвіліна, 2% А;6 хвілін, 98% А;7 хвілін, 98% А;7,1 хвіліны, 2% А;10 хвілін, 2% А. Час працы складае 10 хвілін, а аб'ём ін'екцыі - 20 мкл.Час утрымання BDDE складае каля 3,48 хвілін (ад 3,43 да 4,14 хвілін на аснове эксперыментаў).Мабільную фазу запампоўвалі з хуткасцю патоку 0,25 мл/мін для аналізу ВХ-МС.
Для аналізу BDDE і колькаснага вызначэння з дапамогай MS сістэма UPLC (Waters) спалучаецца з патройным квадрупольным мас-спектрометрам API 3000 (AB SCIEX), абсталяваным крыніцай іянізацыі з электрараспыленнем, і аналіз выконваецца ў рэжыме станоўчых іёнаў (ESI+).
Згодна з аналізам іонных фрагментаў, праведзеным на BDDE, фрагмент з найбольшай інтэнсіўнасцю быў вызначаны як фрагмент, які адпавядае 129,1 Да (малюнак 6).Такім чынам, у рэжыме шматіённага маніторынгу (MIM) для колькаснага вызначэння пераўтварэнне масы (суадносіны масы і зарада [m/z]) BDDE складае 203,3/129,1 Да.Ён таксама выкарыстоўвае рэжым поўнага сканавання (FS) і рэжым сканавання іёнаў прадукту (PIS) для аналізу LC-MS.
Для праверкі спецыфічнасці метаду быў прааналізаваны пусты ўзор (пачатковая рухомая фаза).Ніякага сігналу не было выяўлена ў пустым узоры з пераўтварэннем масы 203,3/129,1 Да.Што тычыцца паўтаральнасці эксперыменту, былі прааналізаваны 10 стандартных ін'екцый 55 частак на мільярд (у сярэдзіне калібравальнай крывой), у выніку чаго рэшткавае стандартнае адхіленне (RSD) <5% (дадзеныя не паказаны).
Рэшткавае ўтрыманне BDDE было вызначана колькасна ў васьмі розных аўтаклававаных гідрагелях BDDE, пашытых HA, што адпавядае чатыром незалежным эксперыментам.Як апісана ў раздзеле «Матэрыялы і метады», колькаснае вызначэнне ацэньваецца па сярэднім значэнні рэгрэсійнай крывой стандартнага развядзення BDDE, якое адпавядае ўнікальнаму піку, выяўленаму пры пераходзе масы BDDE 203,3/129,1 Да, з захаваннем час ад 3.43 да 4.14 хвілін Не чакаючы.На малюнку 2 паказаны прыклад храматаграмы эталоннага стандарту BDDE 10 частак на мільярд.Табліца 1 абагульняе рэшткавае ўтрыманне BDDE у васьмі розных гідрагелях.Дыяпазон значэнняў складае ад 1 да 2,46 ppb.Такім чынам, рэшткавая канцэнтрацыя BDDE ва ўзоры прымальная для выкарыстання чалавекам (<2 праміле).
Малюнак 2 Іонная храматаграма эталоннага стандарту BDDE 10 частак на мільярд (Sigma-Aldrich Co), пераход МС (m/z), атрыманы з дапамогай аналізу LC-MS 203,30/129,10 Да (у станоўчым рэжыме MRM).
Скарачэнні: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидиловый эфір;ВХ-МС, вадкасная храматаграфія і мас-спектраметрыя;MRM, маніторынг множнай рэакцыі;MS, маса;m/z, стаўленне масы да зарада.
Заўвага: Узоры 1-8 з'яўляюцца автоклавированными BDDE гідрагелямі HA.Таксама паведамляецца аб рэшткавым колькасці BDDE ў гідрагелі і піке часу ўтрымання BDDE.Нарэшце, таксама паведамляецца пра існаванне новых пікаў з розным часам утрымання.
Скарачэнні: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидиловый эфір;ГК, гіалуроновая кіслата;MRM, маніторынг множнай рэакцыі;tR, час утрымання;ВХ-МС, вадкасная храматаграфія і мас-спектраметрыя;RRT, адносны час утрымання.
Дзіўна, але аналіз іённай храматаграмы ВХ-МС паказаў, што на аснове ўсіх прааналізаваных узораў гідрагелю ГК, сшытага ў аўтаклаве, быў дадатковы пік пры больш кароткім часе ўтрымання ад 2,73 да 3,29 хвілін.Напрыклад, на малюнку 3 паказана іённая храматаграма ўзору папярочна-шытай ГК, дзе дадатковы пік з'яўляецца пры іншым часе ўтрымання прыблізна 2,71 хвіліны.Выяўлена, што назіраны адносны час утрымання (RRT) паміж нядаўна назіраным пікам і пікам BDDE складае 0,79 (табліца 1).Паколькі мы ведаем, што нядаўна назіраны пік менш захоўваецца ў калонцы C18, якая выкарыстоўваецца ў аналізе ВХ-МС, новы пік можа адпавядаць больш палярнаму злучэнню, чым BDDE.
Малюнак 3. Іённая храматаграма ўзору гідрагеля з пашытай ГК, атрыманай з дапамогай ВХ-МС (канверсія масы MRM 203,3/129,0 Да).
Скарачэнні: ГК, гіалуроновая кіслата;ВХ-МС, вадкасная храматаграфія і мас-спектраметрыя;MRM, маніторынг множнай рэакцыі;RRT, адносны час утрымання;tR, час утрымання.
Каб выключыць магчымасць таго, што назіраныя новыя пікі могуць быць забруджваннямі, якія першапачаткова прысутнічалі ў выкарыстоўванай сыравіне, гэтую сыравіну таксама прааналізавалі з выкарыстаннем таго ж метаду аналізу ВХ-МС.Прааналізаваныя зыходныя матэрыялы ўключаюць ваду, 2% NaHA ў вадзе, 1% NaOH у вадзе і BDDE у той жа канцэнтрацыі, якая выкарыстоўвалася ў рэакцыі сшывання.Іонная храматаграма выкарыстанага зыходнага матэрыялу не паказала ніякага злучэння або піка, і час яе ўтрымання адпавядае новаму назіранаму піку.Гэты факт адхіляе ідэю, што не толькі зыходны матэрыял можа ўтрымліваць якія-небудзь злучэнні або рэчывы, якія могуць перашкаджаць працэдуры аналізу, але няма ніякіх прыкмет магчымага перакрыжаванага забруджвання з іншымі лабараторнымі прадуктамі.Значэнні канцэнтрацыі, атрыманыя пасля аналізу ВХ-МС BDDE і новыя пікі, паказаны ў табліцы 2 (узоры 1-4), а іённая храматаграма - на малюнку 4.
Заўвага: Узоры 1-4 адпавядаюць сыравінным матэрыялам, якія выкарыстоўваюцца для вытворчасці аўтаклаўных гідрагеляў BDDE, пашытых HA.Гэтыя ўзоры не былі апрацаваны ў аўтаклаве.
Скарачэнні: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидиловый эфір;ГК, гіалуроновая кіслата;ВХ-МС, вадкасная храматаграфія і мас-спектраметрыя;MRM, маніторынг множнай рэакцыі.
Малюнак 4 адпавядае ВХ-МС храматаграме ўзору сыравіны, якая выкарыстоўваецца ў рэакцыі сшывання HA і BDDE.
Заўвага: усе яны вымяраюцца пры той жа канцэнтрацыі і суадносінах, якія выкарыстоўваюцца для правядзення рэакцыі сшывання.Нумары для сыравіны, аналізаванай на храматаграме, адпавядаюць: (1) вадзе, (2) 2% воднаму раствору ГК, (3) 1% воднаму раствору NaOH.Аналіз LC-MS праводзіцца для пераўтварэння масы 203,30/129,10 Да (у станоўчым рэжыме MRM).
Скарачэнні: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидиловый эфір;ГК, гіалуроновая кіслата;ВХ-МС, вадкасная храматаграфія і мас-спектраметрыя;MRM, маніторынг множнай рэакцыі.
Вывучаны ўмовы, якія прывялі да адукацыі новых пікаў.Для таго, каб вывучыць, як умовы рэакцыі, якія выкарыстоўваюцца для атрымання папярочна-шытага гідрагеля HA, уплываюць на рэакцыйную здольнасць сшывальнага агента BDDE, што прыводзіць да адукацыі новых пікаў (магчымых пабочных прадуктаў), былі праведзены розныя вымярэнні.У гэтых вызначэннях мы вывучалі і аналізавалі канчатковы сшывальнік BDDE, які апрацоўвалі рознымі канцэнтрацыямі NaOH (0%, 1%, 0,1% і 0,01%) у водным асяроддзі з наступнай апрацоўкай у аўтаклаве або без яе.Працэдура бактэрый для мадэлявання тых жа ўмоў такая ж, як метад, які выкарыстоўваецца для атрымання папярочна-шытага гідрагеля HA.Як апісана ў раздзеле «Матэрыялы і метады», пераход масы ўзору быў прааналізаваны з дапамогай ВХ-МС да 203,30/129,10 Да.Разлічваюцца BDDE і канцэнтрацыя новага піка, і вынікі паказаны ў табліцы 3. Ва ўзорах, якія не былі апрацаваны ў аўтаклаве, новых пікаў не выяўлена, незалежна ад прысутнасці ў растворы NaOH (узоры 1-4, табл. 3).Для аўтаклаўных узораў новыя пікі выяўляюцца толькі ў прысутнасці NaOH у растворы, а адукацыя піка, здаецца, залежыць ад канцэнтрацыі NaOH у растворы (узоры 5-8, табл. 3) (RRT = 0,79).На малюнку 5 паказаны прыклад іённай храматаграмы, якая паказвае два аўтаклаўных узору ў прысутнасці або адсутнасці NAOH.
Скарачэнні: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидиловый эфір;ВХ-МС, вадкасная храматаграфія і мас-спектраметрыя;MRM, маніторынг множнай рэакцыі.
Заўвага: Верхняя храматаграма: узор апрацоўвалі 0,1% водным растворам NaOH і автоклавировали (120°C на працягу 20 хвілін).Ніжняя храматаграма: узор не апрацоўвалі NaOH, а автоклавировали ў тых жа ўмовах.Канверсія масы 203,30/129,10 Да (у станоўчым рэжыме MRM) была прааналізавана з дапамогай LC-MS.
Скарачэнні: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидиловый эфір;ВХ-МС, вадкасная храматаграфія і мас-спектраметрыя;MRM, маніторынг множнай рэакцыі.
Ва ўсіх аўтаклававаных узорах, з NaOH або без яго, канцэнтрацыя BDDE была значна зніжана (да 16,6 разоў) (узоры 5-8, табл. 2).Зніжэнне канцэнтрацыі BDDE можа быць звязана з тым, што пры высокіх тэмпературах вада можа дзейнічаць як аснова (нуклеафіл), каб адкрыць эпаксіднае кольца BDDE з адукацыяй 1,2-дыёльнага злучэння.Монаізатопная якасць гэтага злучэння адрозніваецца ад якасці BDDE і таму не будзе закранута.LC-MS выявіла зрушэнне масы 203,30/129,10 Да.
Нарэшце, гэтыя эксперыменты паказваюць, што стварэнне новых пікаў залежыць ад прысутнасці BDDE, NAOH і працэсу аўтаклававання, але не мае нічога агульнага з HA.
Новы пік, знойдзены пры часе ўтрымання прыблізна 2,71 хвіліны, затым ахарактарызавалі з дапамогай ВХ-МС.Для гэтай мэты BDDE (9,9 мг/мл) інкубавалі ў 1% водным растворы NaOH і автоклавировали.У табліцы 4 характарыстыкі новага піка параўноўваюцца з вядомым эталонным пікам BDDE (час утрымання прыкладна 3,47 хвіліны).На аснове аналізу іоннай фрагментацыі двух пікаў можна зрабіць выснову, што пік з часам утрымання 2,72 хвіліны паказвае тыя ж фрагменты, што і пік BDDE, але з рознай інтэнсіўнасцю (малюнак 6).Для піка, які адпавядае часу ўтрымання (PIS) 2,72 хвіліны, больш інтэнсіўны пік назіраўся пасля фрагментацыі пры масе 147 Да.Пры канцэнтрацыі BDDE (9,9 мг/мл), якая выкарыстоўвалася ў гэтым вызначэнні, пасля храматаграфічнага падзелу таксама назіраліся розныя рэжымы паглынання (УФ, λ=200 нм) ва ўльтрафіялетавым спектры (малюнак 7).Пік з часам утрымання 2,71 хвіліны ўсё яшчэ бачны пры 200 нм, у той час як пік BDDE не можа назірацца на храматаграме ў тых жа ўмовах.
Табліца 4. Вынікі характарыстыкі новага піка з часам утрымання каля 2,71 хвіліны і піка BDDE з часам утрымання 3,47 хвіліны
Заўвага: каб атрымаць гэтыя вынікі, ВХ-МС і ВЭЖХ аналізы (MRM і PIS) былі выкананы на двух піках.Для аналізу ВЭЖХ выкарыстоўваецца УФ-дэтэкцыя з даўжынёй хвалі 200 нм.
Скарачэнні: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидиловый эфір;ВЭЖХ, высокаэфектыўная вадкасная храматаграфія;ВХ-МС, вадкасная храматаграфія і мас-спектраметрыя;MRM, маніторынг множнай рэакцыі;m/z, стаўленне масы да зарада;PIS, іённае сканаванне прадукту;ультрафіялет, ультрафіялет.
Заўвага: Масавыя фрагменты атрыманы з дапамогай аналізу LC-MS (PIS).Верхняя храматаграма: мас-спектр фрагментаў стандартнага ўзору BDDE.Ніжняя храматаграма: мас-спектр новага выяўленага піка (RRT, звязаны з пікам BDDE, складае 0,79).BDDE апрацоўвалі ў 1% растворы NaOH і автоклавировали.
Скарачэнні: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидиловый эфір;ВХ-МС, вадкасная храматаграфія і мас-спектраметрыя;MRM, маніторынг множнай рэакцыі;PIS, іённае сканаванне прадукту;RRT, адносны час утрымання.
Малюнак 7. Іонная храматаграма іёна-папярэдніка 203,30 Да і (A) новы пік з часам утрымання 2,71 хвіліны і (B) УФ-выяўленне піка эталоннага стандарту BDDE на 3,46 хвіліне пры 200 нм.
Ва ўсіх вырабленых гідрагелях са сшытамі ГК было заўважана, што рэшткавая канцэнтрацыя BDDE пасля колькаснага вызначэння ВХ-МС была <2 праміле, але ў аналізе з'явіўся новы невядомы пік.Гэты новы пік не адпавядае прадукту стандарту BDDE.Стандартны прадукт BDDE таксама прайшоў аналагічны аналіз якасці (пераўтварэнне MRM 203,30/129,10 Да) у станоўчым рэжыме MRM.Як правіла, іншыя аналітычныя метады, такія як храматаграфія, выкарыстоўваюцца ў якасці лімітавых тэстаў для выяўлення BDDE ў гідрагелях, але максімальная мяжа выяўлення (LOD) крыху ніжэйшая за 2 праміле.З іншага боку, да гэтага часу ЯМР і МС выкарыстоўваліся для характарыстыкі ступені сшывання і/або мадыфікацыі ГК у фрагментах адзінак цукру ў прадуктах сшытай ГК.Мэтай гэтых метадаў ніколі не было колькаснае выяўленне рэшткавага BDDE пры такіх нізкіх канцэнтрацыях, як мы апісваем у гэтым артыкуле (LOD нашага метаду LC-MS = 10 частак на мільярд).
Час публікацыі: 01 верасня 2021 г